Northern和Southern印迹实验方案

核酸与蛋白质等大分子向固相支撑膜的转移称为印迹。通过凝胶电泳分离的DNA和RNA分子的片段分别在称为Southern和Northern印迹的过程中转移到尼龙或硝酸纤维素膜上。Southern印迹由Edwin Southern于1975年推出，是一种检测DNA样品中特定DNA序列的方法。基于该方法出现的其他印迹技术被称为Northern印迹（用于RNA）、Western印迹（用于蛋白质）、Eastern印迹（用于翻译后蛋白质修饰）和Southwestern印迹（用于DNA-蛋白质相互作用）。

Southern和Northern印迹实验方案包括以下主要步骤：

DNA/RNA的纯化：从细胞或组织来源中提取和纯化DNA/RNA。

消化DNA：用限制酶把DNA消化成片段。RNA不需要该步骤。

凝胶电泳：在琼脂糖凝胶上分离DNA片段。RNA样品可以在琼脂糖凝胶上用甲醛分离，甲醛作为限制RNA分子二级结构的变性剂。

转膜：将DNA/RNA片段从凝胶转移到尼龙膜上。

预杂交（封闭）：用含有鲑鱼精子DNA的预杂交溶液清洗尼龙膜，以封闭非特异性DNA相互作用并降低背景噪音。

探针的制备：准备新的探针DNA并用32Pα标记的dCTP标记。

杂交：用标记的探针孵育印迹。

探针的检测：在-80°C下曝光胶片，检测探针和目标DNA/RNA序列。

DNA/RNA印迹操作程序中的步骤

Southern印迹实验方案

材料

—用于DNA分离和纯化的试剂

—用于限制性消化DNA的试剂

—琼脂糖凝胶电泳的试剂和缓冲液

—琼脂糖凝胶电泳仪

—Whatman滤纸

—纸巾

—带正电荷的尼龙膜

—鲑鱼精子DNA

—杂交管

—X光胶片

缓冲液

—10X TBE，用于凝胶电泳。对于较大的DNA片段，可以使用TAE缓冲液代替TBE。

—20X SSPE，用作预杂交和转膜缓冲液。在类似的印迹实验方案中，可以使用20X SSC（）代替SSPE。

—变性溶液，用于使dsDNA变性，以使其与探针结合。

—中和溶液，用于在变性dsDNA后中和凝胶。

—Denhardt溶液，在预杂交过程中用于封闭非特异性DNA杂交。

—2X预杂交溶液，用于准备探针杂交所用的膜。

—1X探针缓冲液，用于探针混合物。（现制备，100μL，1 M TRIS，pH 7.6 50μL，2 M MgCl2 5μL，0.5 M DTT 10μL，水35 μL）

—1X探针混合物（27μL，探针缓冲液 2.7μL ，寡核苷酸探针（0.2μg/μL）2μL，T4磷酸核苷酸激酶（PNK）1μL，水11.3μL ，32P-ATP 10 µL）

—6X低苛性洗涤溶液，用于去除低同源性杂交并降低背景噪音。（600 mL洗涤溶液，20X SSPE 180 mL，10% SDS 12 mL，水408 mL。）

—1X高苛性洗涤溶液，用于去除紧密同源杂交，并进一步降低背景噪音。（600 mL洗涤溶液，20X SSPE 30 mL，10% SDS 12 mL，水558 mL。）

DNA分离

—通用型DNA提取试剂盒（PS1356）

—植物基因组DNA提取试剂盒（PS1357）

—多糖多酚植物基因组DNA提取试剂（PS1358）

—真菌基因组DNA提取试剂盒（PS1359）

—酵母基因组DNA提取试剂盒（PS1360）

—细菌基因组DNA提取试剂盒（PS1361）

—病毒基因组DNA/RNA提取试剂（PS1362）

—土壤基因组DNA试剂盒（PS1363）

—粪便基因组DNA提取试剂（PS1364）

—海洋动物基因组DNA提取试剂盒（PS1365）

—游离核酸DNA中量提取试剂盒（PS1366）

—微量/临床基因组DNA快速提取试剂盒（PS1367）

—柱式血液基因组DNA小量提取试剂盒 (0.1-1ml)（PS1368）

—非柱式血液基因组DNA小量提取试剂盒(0.1-1ml)（PS1369）

—唾液DNA提取试剂盒（PS1370）

—口腔拭子基因组DNA提取试剂盒（PS1371）

—新型固定组织基因组DNA提取试剂盒（PS1372）

—DNA/RNA/蛋白共提试剂盒（PS1373）

详细实验方案请登陆http://www.jm-bio.com查看说明书。

限制性酶切

用适当的限制性酶在37 °C消化DNA 2-24 h。如果DNA样品是克隆衍生产物，则1-2小时的消化时间就足够了。对于基因组DNA，通常需要用过量的酶（5-10X）孵育过夜。

如有必要，使用乙醇沉淀法浓缩消化的DNA。在凝胶上分离之前，必须完全除去痕量乙醇。

凝胶电泳

在琼脂糖凝胶上溶解消化的DNA。TAE应该用于较短时间的运行（<4小时）和较大的DNA片段，而TBE应该用于较长时间的运行（> 4小时）和较小的DNA片段（<1kb）。用溴化乙啶染色凝胶，并使用UV透照仪获得凝胶图像。如果在电泳之前将溴化乙啶掺入琼脂糖中，则可以在运行后立即获得凝胶图像。因为溴化乙啶的毒性，我们提供无毒核酸染料红色(PS0533,10000× in DMSO;PS1223,10000× in H2O)和绿色(PS1183,10000× in H2O)

转膜

在转膜步骤中，来自电泳凝胶的DNA（或RNA）将被转移到尼龙膜上，以使探针易于杂交和检测。

—将凝胶转移到含有变性溶液的托盘中，溶液要足以完全覆盖凝胶。用这种溶液洗涤凝胶两次，每次洗涤在摇床上持续25分钟。

—用水冲洗凝胶两次。

—用中和溶液洗涤凝胶两次，每次洗涤在摇床上持续15分钟。

—用水冲洗凝胶两次。

—用20X SSPE在摇床上洗涤凝胶30分钟。

—在上述步骤中，准备用于转膜步骤的Whatman纸和膜。

—切下一条尼龙膜，将其浸泡在水中。切下一条比凝胶宽的Whatman纸，将其浸泡在10X SSPE缓冲液（转膜缓冲液）中。

—切下三条几乎与凝胶大小相同的Whatman纸。

—切下数张几乎与凝胶大小相同的纸巾。

—在含有10X SSPE的托盘上放置一个稳定的平台。

—在平台上放一张saran保鲜膜。在saran保鲜膜上，放一张浸有10X SSPE的Whatman纸。用玻璃棒在它们上面滚动，以把气泡撵出。确保Whatman纸的边缘接触托盘中的—SSPE缓冲液。这张Whatman纸将充当芯子，将SSPE缓冲液向上吸并穿过凝胶，以在尼龙膜上沉淀DNA条带。

—将凝胶面朝下放在湿润的Whatman纸上。将膜放在凝胶上面。用玻璃棒在它们上面滚动，以把气泡撵出。

—在膜上放置三层Whatman纸。用玻璃棒在它们上面滚动，以把气泡撵出。

—在这上面放一叠纸巾，然后放上重物（如玻璃板）。

—让这个组装静置过夜，以完全转移DNA片段。将不超过15kb的DNA片段转移大约需时18小时。

—转移完成后，将印迹放入自动设置的UV交联机中。进行UV交联以使DNA或RNA与尼龙膜共价键合，这在检测期间增强杂交信号。另一个选择是在转膜后烘干膜，这使—核酸与膜之间形成非共价的半永久键合。DNA不能与硝酸纤维素膜进行UV交联，只能烘烤。

预杂交（封闭）

—预杂交（也称为封闭）步骤的作用是最大限度地减少探针对尼龙膜的非特异性附着。鲑鱼精子DNA(D10069)通常用作封闭剂，用来防止探针粘附到膜上，确保它只与已经转移到膜上的目标DNA条带相互作用。

杂交

DNA的互补链（探针）用于检测应存在于膜上的目标序列。来自两种不同来源的DNA组合形成“杂合”dsDNA，但前提是这两条链是同源的。

—制备1X探针混合物，在37°C水浴中孵育40分钟。

—让探针混合物通过G-25 Sephadex柱，以去除游离标记（未掺入的探针）。

—用液体闪烁法确定探针的特异活性。

—将10 mL杂交溶液加热至49°C，向其中加入10-15 X6 cpm的探针，并充分混合。

—将印迹中的预杂交溶液丢弃；在标记的探针中添加杂交溶液。49°C孵育过夜。

—将6X洗涤溶液温热至49°C。将印迹中的杂交溶液丢弃，添加6X洗涤溶液。

—将6X低苛性洗涤溶液加热至49°C。将印迹中的杂交溶液丢弃，添加6X洗涤溶液。低苛性洗涤去除低同源性杂交，以留下高同源性杂交，从而精炼目标DNA样品。

—制备1X高苛性洗涤溶液，并将其加热至49°C。将印迹洗涤约30秒并丢弃洗涤溶液。该步骤使用高苛性溶液去除紧密同源的杂交，以进一步精炼目标DNA。

—使用盖革计数器检查印迹的活性。如果每秒有10-50条具有照射峰值的条带，就是理想的结果。如果背景太高，则用1X洗涤溶液再次清洗印迹。

检测探针

—将印迹放入衬有新的saran保鲜膜的暗盒中，小心地将印迹包好，确保印迹和保鲜膜之间没有气泡。

—将暗盒放入暗室，将X光胶片放在印迹上。锁上暗盒，将其置于-80 °C过夜。在第二天显影。

—可将另一张X光片放在印迹上，并放回-80 °C进行另一次曝光。

NORTHERN印迹实验方案

Northern印迹实验方案类似于Southern印迹实验方案，只是RNA序列是在掺入甲醛的变性琼脂糖凝胶上分离。

RNA分离

哺乳动物细胞或组织和使用总RNA提取试剂。

为了确定RNA的质量和浓度，分别在260 nm和280 nm处读取样品的吸光度。吸光度比值A260/A280为 1.8-2.1 表示 RNA的质量较好。

我们提供多款总RNA提取试剂

—产品编号PS0808，适用范围广泛，可以从动物组织、 植物材料、 各种微生物及培养细胞等样品中提取总RNA。

—产品编号PS1175，是一款免氯仿的RNA提取试剂。与传统 Trizol 提取方法相比，本产品不需要使用氯仿进行分层，操作更简单，且全程可在常温进行。

—产品编号PS1225，本产品更适合和血液的提取RNA。

凝胶电泳

—DNA琼脂糖凝胶电泳使用移液器将样品小心地加入孔中。如果需要，也可加入含有各种大小 RNA 片段(R7020, R7644)的适当标记物。

—琼脂糖凝胶电泳使RNA变性。

转膜

转膜设置、预杂交、杂交和检测的实验方案与Southern blotting相同。

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